0 引言 Introduction

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病[1]。糖尿病的发病率随着人们生活水平的提高逐年增加，而糖尿病并发症是导致糖尿病患者死亡的主要原因。肝脏是胰岛素作用的主要靶器官，也是糖尿病慢性并发症累及的靶器官之一，有报道称糖尿病可增加患肝损伤、肝硬化、肝癌等肝脏疾病的风险[2-4]，可引起强大的代偿功能和早期的损害表现，糖尿病引起的肝损害在早期阶段容易被忽视。然而当肝损伤持续发展到脂肪肝、肝硬化甚至肝癌时，通常病情已不可逆转。目前糖尿病的治疗方法有多种，其中运动疗法能够增加胰岛素的敏感性，但训练计划制定不合理如强度过大，可能会产生相反的效果，引起高血压和心绞痛等并发症。因此，运动强度的选择尤为重要，强度设置的科学性是运动疗法的关键。该研究旨在探讨中等强度跑台运动干预对糖尿病发生过程中肝损伤的改善情况，为进一步研究糖尿病的干预机制提供实验和理论依据。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 随机对照动物实验。

1.2 时间及地点 实验于2017年10月至2018年2月在武汉体育学院实验室完成。

1.3 材料

1.3.1 实验动物 30只SPF级6周龄雄性SD大鼠购于湖北省实验动物研究中心，许可证号：SCXK(鄂)2015-0018；分笼饲养，室温，自然光照。

1.3.2 实验试剂及饲料 链脲佐菌素(美国Sigma生物技术公司)；柠檬酸、柠檬酸钠(上海沪试股份有限公司生产)；快速血糖仪及配套试纸(三诺生物传感股份有限公司)；大鼠跑台(北京众实迪创科技发展有限公司)；苏木精(珠海贝索生物技术有限公司)；一抗、二抗(美国亚科因生物科技有限公司)；Ⅳ型胶原ELISA试剂盒(上海希美化学有限公司)；酶标仪(深圳雷杜生命科学股份有限公司)；普通词料和高糖高脂饲料均由湖北省实验动物中心提供。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组及运动干预 适应性饲养1周后，将大鼠随机分为3组，每组10只，分别为：①正常对照组，普通膳食喂养8周，不运动；②糖尿病对照组，高糖高脂膳食饲养8周，不运动；③糖尿病运动干预组，高糖高脂膳食饲养同糖尿病对照组，同时施加中等强度运动(参照BEDFORD等[5-6]方法进行跑台训练：跑台坡度为5°，速度为15 m/min，1 h/d，5 d/周，与高糖高脂饲养同时开始、结束)。

1.4.2 糖尿病大鼠模型建立 ①试剂配制：柠檬酸2.1 g加入100 mL双蒸水中配成A液，柠檬酸钠2.94 g加入100 mL双蒸水中配成B液。将A，B液按1∶1.32比例混合，调节pH值为4.5，即0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液。将链脲佐菌素溶解于0.1 mmol/L柠檬酸缓冲液中，配制浓度为2%的链脲佐菌素液。链脲佐菌素需4 ℃低温保存及新鲜配制。②模型建立：在喂养8周(56 d)后，3组大鼠禁食不禁水12 h，称质量，正常对照组大鼠按30 mg/kg一次性腹腔注射柠檬酸缓冲液，糖尿病对照组、糖尿病运动干预组大鼠按30 mg/kg一次性腹腔注射2%链脲佐菌素柠檬酸缓冲液，之后继续给予高糖高脂饮食喂养，不运动，制作糖尿病大鼠模型。链脲佐菌素注射后第7天用血糖测试仪检测大鼠尾静脉随机血糖。参照糖尿病大鼠模型的成功标准：血糖在16.7 mmol/L以上视为造模成功[7-8]。

1.4.3 苏木精-伊红染色 检测随机血糖后，剖腹取出肝脏，采用体积分数为10%中性甲醛溶液固定10 h，随后进行常规脱水及石蜡包埋，并切成厚度为4 μm的切片，梯度二甲苯脱蜡、水化、苏木精染色、0.8%盐酸乙醇分化、PBS冲洗、伊红染色、梯度乙醇脱水，二甲苯透明、封固、镜检。

1.4.4 Masson染色 取大鼠肝组织固定于Bouin液，流水冲洗过夜，常规脱水石蜡包埋、切片脱蜡至水，Weigert铁苏木精(Weigert铁苏木精A、B液等比例混合液)染色、1%盐酸乙醇分化、丽春红酸性品红染色、磷钼酸溶液处理、苯胺蓝染液复染、1%冰醋酸处理、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、封固、镜检。

1.4.5 免疫组织化学方法检测大鼠肝脏α-SMA的表达 ①石蜡切片脱蜡、环保透明剂处理、梯度乙醇至水、高温高压修复、冷却至室温、TBS缓冲液冲洗、体积分数为3%H2O2处理、TBS冲洗、一抗、二抗孵育、TBS冲洗、滴加 50 μL新鲜配置的DAB、苏木精复染、盐酸乙醇分化、返蓝液返蓝、梯度乙醇脱水干燥、二甲苯透明、中性树胶封固；②显微镜下观察α-SMA的表达及分布，染色结果应用Image-Pro Plus6.0软件对图片进行分析，计算其累计吸光度值。

1.4.6 ELISA检测大鼠Ⅳ型胶原水平 摘大鼠眼球取血，采用ELISA试剂盒检测大鼠Ⅳ型胶原水平，严格按照说明步骤进行操作。37 ℃平衡ABC和TMB稀释显色液，在酶标仪450 nm波长处读取数值，绘制标准曲线，根据标准品的质量浓度及对应的吸光度值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的吸光度值在回归方程上计算出对应的样品质量浓度。

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